دستگاه pcr چیست :
این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.
دستگاه PCRبطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.
تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده میشود.
دستگاه PCRبطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.
تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده میشود.
مراحل PCR
· مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30S) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.
· مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته میشود. ما بین دو پرایمر ساخته میشود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30S در دمای 65 - 30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.
· مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.
Real-Time PCR به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری در بازار
· مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30S) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.
· مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته میشود. ما بین دو پرایمر ساخته میشود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30S در دمای 65 - 30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.
· مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.
Real-Time PCR به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری در بازار
که اجازه پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول PCR در زمان جمع شدن را می‌دهد، این روش ابداع شد. در این روش از کاوشگرها یا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای 5 یا 3 استفاده میشود. که امکان پایش پیوسته محصول PCR را بدون جداسازی آنها در روش‌های الکتروفورز در ژل آگاروز یا ژل پلی آکریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال 1992 کشف شد. این روش به دلیل کاهش زمان سیلک‌های PCR، حذف مرحله Post-PCR و کاربرد نشانگرهای فلوروژنیک و روش‌های حساس آشکارسازی تابش آنها باعث افزایش سرعت این سیستم نسبت به سیستم PCR معمولی شده است. سازندگان و کاربران این روش سعی می‌کنند محصول PCR کوچک‌تر طراحی کنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده PCR را بهینه نمی‌کند. البته این روش دارای معایبی نیز است از جمله می‌توان به عدم ناتوانی در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم‌ها با شیمی برخی رنگ‌های فلورژنیک اشاره کرد. برای شناسایی بسیاری از ویروس‌های عامل بیماری‌های انسان از این روش استفاده شده است.
اصول کار با دستگاه Real time PCR
اصول کار با دستگاه Real time PCR
وجه افتراق Real Time PCR با PCR نوع معمولی به کار گرفتن یک نشانگر فلورسنت در واکنش جهت ردیابی محصول واکنش می باشد. این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه (Threshold)باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی داری دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد. به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانهای می رسد که به مقدارمشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه ( سیکلی از PCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CT شناخته می شود.
برای
خرید دستگاه pcrیا
ترمال سایکلر
و اطلاع از
قیمت دستگاه pcr
می توانید به لینک زیر مراجعه نمایید :
http://tajhizyar.com/lab-equipment/pcr-machine/
به طور کلی Real time PCR چند مرحله دارد که عبارت است از:
1- Baseline rgion : در این مرحله هیپ گونه نوری قابل رویت نیست.
2- Exponential phase : محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد تصاعدی مربوط به واکنش آغاز می شود.
3- The liner phase: ترکیبات واکنش و کارایی آنها روبه اتمام است.
4- The plateau phase: ترکیبات واکنش از بین می روند و افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.
روشReal time PCR می تواند به دو صورت One step ( همزمان در یک واکنش ساخت cDNA از RNA و تکثیر آن صورت می گیرد) و Two step ( ابتدا ساخت cDNA و در واکنش دیگر تکثیر آن ) انجام میشود.
1- Baseline rgion : در این مرحله هیپ گونه نوری قابل رویت نیست.
2- Exponential phase : محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد تصاعدی مربوط به واکنش آغاز می شود.
3- The liner phase: ترکیبات واکنش و کارایی آنها روبه اتمام است.
4- The plateau phase: ترکیبات واکنش از بین می روند و افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.
روشReal time PCR می تواند به دو صورت One step ( همزمان در یک واکنش ساخت cDNA از RNA و تکثیر آن صورت می گیرد) و Two step ( ابتدا ساخت cDNA و در واکنش دیگر تکثیر آن ) انجام میشود.
انواع ژرمیناتور